酶联免疫吸附测定法，即ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一门基于抗原抗体结合的技术，广泛应用于血清、血浆、细胞上清液等检测，发展至今已有50多年的历史了，已经渗透到各种科学研究中，成为生物医药研究不可或缺的经典技术。基于平时进行ELISA实验时遇到的一些问题，做了如下经验汇总：

Q   1、如何避免边缘效应？

A   边缘效应是指在实验过程中，96孔板周围孔与中心孔表面或热力学特征的不同而产生的不均匀现象。ELISA实验通常体现为边缘孔的温度较高，孔内液体挥发较快，导致边缘孔的检测OD值较中间孔偏高。减小边缘效应的常用方法有：①将96孔板的周围孔不用，填充上实验buffer；②使用封板膜；③使用恒温恒湿箱；④采用水浴加热。

Q   2、ELISA实验时，有必要进行封闭吗？

A   一般情况下，包被的抗原或抗体使用浓度较低，特别是抗体分子较大，包被后的酶标板表面存在未被占据的空隙。封闭就是让不相关的蛋白质填充这些空隙，从而避免后续步骤中加入的样品结合到板子上产生非特异性吸附。常用的封闭试剂有BSA，脱脂牛奶和血清等。

Q   3、如何选择合适的二抗？

A   在进行ELISA方法优化时，非常有必要尝试多种抗体，包括多克隆与单克隆、不同的宿主物种、不同供应商的抗体。一般而言，单克隆抗体比多克隆抗体灵敏度高，特异性好，多克隆抗体批次间差异要大一些。同时，应确保二抗的种属来源与包被抗原/抗体种属来源不同。

在用眼一段时间后要注意休息，坚持做眼保健操,通过对眼部的按摩,能够促进局部血液循环。

Q   4、如何判断四参数拟合时上平台是否为真实的结合平台？

A   使用酶标仪进行读数时，假如最高OD值达到3.5，并且出现了上平台，这是否就是抗原抗体的结合平台呢？这要看酶标仪本身的线性检测范围。例如，某酶标仪的检测范围是0-4 OD，而该仪器确保的线性检测范围是0-3 OD，一般需将检测信号值的最高值控制在3OD左右。而实验中的OD为3.5，实际是到了仪器检测上限而非结合平台，是假平台。因此在进行ELISA实验时，不能为了得到一个完整的S曲线，而延长显色时间使OD值超过仪器线性检测范围。

Q   5、包被浓度如何控制？

A   包被浓度取决于实验目的。通常在利用ELISA进行定量实验时，包被抗原的量要远大于样品的量，这样才能抵消抗原抗体可逆反应带来的影响。而进行亲和力分析时，包被抗原的浓度要远小于抗体的浓度，这样得到的曲线EC50值才能代表亲和力常数KD。

Q   6、显色时间如何控制？

A   显色时间需控制在合理范围内。显色时间太短会导致检测范围太窄；显色时间太长会导致本底很高且灵敏度差。可以通过预读，判断是否可以终止。采用TMB显色时，可以不间断的读取波长为370nm时的OD值，一般OD370nm为1.2时，终止后OD450nm大约为2.0。

Q   7、如何降低本底？

A   ①洗涤：可以在清洗液中添加吐温或曲通 ，或增加洗涤次数；

     ②封闭：尝试不同的封闭试剂、提高封闭液浓度或增加封闭时间；

     ③显色时间过长会增加本底，因此不能过度显色；

     ④二抗浓度过高有可能增加本底，可采用棋盘法摸索出合适的酶联抗体的浓度和包被浓度。

Q   8、ELISA法如何进行抗原抗体亲和力测定？还有别的替代方法吗？

A   ELISA测定亲和力时，需要满足几个条件：①首先需要有完整的四参数拟合S型曲线，即有平台出现；②包被的抗原浓度要足够小；③需要有合适的酶联抗体浓度，酶联抗体浓度过低可能会出现假平台；④需要控制显色时间，显色时间过长超过酶标仪线性检测范围也可能导致假平台。

但由于ELISA灵敏度限制，在一些亲和力较弱的抗原抗体中，采用ELISA法得不到平台，也就无法测得准确的亲和力数值。可以采用非标记亲和力测定法，目前常用的技术有生物膜层干涉 (BLI)和表面等离子共振 (SPR)，这两个都是药典认可的方法。